1993 年，Higuchi 等人將PCR 技術(shù)和封閉式檢測(cè)相結(jié)合，對(duì)目的核酸數(shù)量進(jìn)行定量分析，提出了熒光定量PCR 技術(shù)的概念。1995 年美國(guó)PE 公司成功研制了TaqMan 技術(shù)，1996 年又推出了首臺(tái)熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)，通過檢測(cè)每個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度，并使用Ct值進(jìn)行分析，達(dá)到定量核酸的目的，自此Real-Time PCR 技術(shù)才得以真正的推廣和應(yīng)用。到目前為止，實(shí)時(shí)熒光定量已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等科學(xué)領(lǐng)域。
1 原理
Real-Time PCR 是在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號(hào)對(duì)整個(gè)PCR 進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，從而達(dá)到對(duì)未知起始模板進(jìn)行定量分析的目的。它是一種將酶動(dòng)力學(xué)、核酸擴(kuò)增、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)。隨著PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光信號(hào)，這樣就可以通過熒光信號(hào)強(qiáng)度變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR 產(chǎn)物量的變化，從而得到一條描述PCR 動(dòng)態(tài)進(jìn)程的曲線，即擴(kuò)增曲線。
實(shí) 時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增曲線可以分為4 個(gè)階段: 基線期、早期指數(shù)期、對(duì)數(shù)-線性期和平臺(tái)期，見圖1。在基線期( 通常1 ～ 15 個(gè)循環(huán)) ，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化; 早期指數(shù)期，熒光信號(hào)超過背景信號(hào)并到達(dá)閾值( 通常為基線信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍) ，此時(shí)循環(huán)數(shù)稱為Ct( Cycle threshold) 值或Cp( Crossingpoint) 值，Ct值與模板起始濃度的對(duì)數(shù)值成反比線性關(guān)系，因而Ct值可被用來定量模板起始濃度; 對(duì)數(shù)-線性期，在理想反應(yīng)條件下每經(jīng)歷一個(gè)循環(huán)，PCR 產(chǎn)物加倍; 平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR 產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始模板拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 能準(zhǔn)確地確定初始模板拷貝數(shù)，結(jié)果重現(xiàn)性好，誤差小，與常規(guī)PCR 在終點(diǎn)定量上相比更具重要意義。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果不僅可以定性( 判斷一段序列的存在與否) ，還可定量( 確定基因的拷貝數(shù)) ，而常規(guī)PCR 只能做到半定量。另外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的反應(yīng)和檢測(cè)都是在封閉的反應(yīng)管中進(jìn)行的，樣品污染幾率大大降低，無(wú)需擴(kuò)增后的實(shí)驗(yàn)操作，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。
2 Real-Time PCR 定量類型
實(shí)時(shí)熒光定量分析包括絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量是對(duì)未知樣品絕對(duì)拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定的方法;相對(duì)定量不是測(cè)定樣品的絕對(duì)拷貝數(shù)，而是比較樣品之間同一目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以期分析樣品之間目的基因的表達(dá)差異。
2. 1 絕對(duì)定量
絕對(duì)定量是使用一系列已知濃度( 通常為5 ～ 6個(gè)梯度稀釋的濃度) 的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立Ct值與起始模板量[總核糖核酸( RNA) 或脫氧核糖核酸( DNA) ] 的對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系，達(dá)到對(duì)未知樣品絕對(duì)的定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制首先是標(biāo)準(zhǔn)品的選擇，標(biāo)準(zhǔn)品可以是DNA( 重組質(zhì)粒DNA、基因組DNA、純化的RT-PCR 產(chǎn)物及合成的寡核苷酸DNA) 或RNA( 體外轉(zhuǎn)錄RNA[5，8-10]) 。但是為了保持與待測(cè)樣品間擴(kuò)增效率的一致性，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)盡量選擇與待測(cè)樣品結(jié)構(gòu)近似的樣品，該方法要求梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品都必須與待測(cè)樣品同時(shí)平行擴(kuò)增，且待測(cè)樣品濃度應(yīng)包含在已知標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍之內(nèi)。
2. 2 相對(duì)定量
相對(duì)定量解析方法相對(duì)復(fù)雜，一般用于基因表達(dá)分析。根據(jù)選用的標(biāo)準(zhǔn)不同可分為以質(zhì)量單位為標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)定量和以內(nèi)參基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)的相對(duì)定量。以質(zhì)量單位( 細(xì)胞的數(shù)目或核酸的微克數(shù)) 作為標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)定量?jī)?yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概念簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)分析處理簡(jiǎn)單易學(xué)，缺點(diǎn)是很難準(zhǔn)確量化初始材料; 而以內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)定量?jī)?yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確量化初始材料的載量，尤其當(dāng)初始材料受限時(shí)，進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析十分方便。缺點(diǎn)是要求得到一個(gè)或多個(gè)在所有待測(cè)樣本中恒定表達(dá)的內(nèi)參基因。目前，使用較多的是以內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)的定量方法。
2. 2. 1 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)為了確保定量結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，在qRT-PCR 中需選擇合適的內(nèi)參基因?qū)Σ煌瑯悠分g因質(zhì)量、RNA 的提取效率以及反轉(zhuǎn)錄效率不同所產(chǎn)生的差異進(jìn)行校正，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣品中RNA 的定量和數(shù)據(jù)歸一化。理想的內(nèi)參基因應(yīng)滿足以下條件: 1) 在不同發(fā)育階段和不同組織器官中表達(dá)穩(wěn)定; 2) 表達(dá)不受生物學(xué)、實(shí)驗(yàn)條件的影響; 3) 其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目的基因表達(dá)水平相近。在植物qRT-PCR 研究中用的最多的內(nèi)參基因通常是看家基因( housekeepinggenes) ，然而越來越多的研究表明，看家基因在不同類型細(xì)胞和不同生理狀態(tài)下的表達(dá)并不是恒定不變的，若盲目選擇看家基因作為內(nèi)參，可能會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)分析結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至得到相反的或者錯(cuò)誤的結(jié)論。因此選擇合適的、穩(wěn)定的內(nèi)參用于基因表達(dá)的差異分析非常關(guān)鍵。目前，geNorm、NormFinder、BestKeeper、DeltaCT等分析方法被廣泛用于內(nèi)參基因的篩選與評(píng)價(jià)。Xie 等將上述4 種方法整合成一個(gè)在線的分析工具—RefFinder，用于各種實(shí)驗(yàn)條件下內(nèi)參的篩選，避免了單個(gè)分析方法的片面性。
2. 2. 2 引物的特異性及擴(kuò)增效率的.檢測(cè)為了使結(jié)果準(zhǔn)確可靠，qRT-PCR 中還要求引物的特異性好，擴(kuò)增效率接近100%。劉正霞等研究顯示，引物的特異性和擴(kuò)增效率對(duì)定量PCR 結(jié)果分析有顯著影響。
引物的特異性評(píng)估: 引物的特異性可以通過凝膠電泳、PCR 產(chǎn)物克隆測(cè)序以及qRT-PCR 的熔解曲線來檢查。凝膠電泳的條帶若為單一條帶，則說明PCR 產(chǎn)物特異性好，若有多條則說明特異性差，需要優(yōu)化PCR 反應(yīng)條件和體系或重新設(shè)計(jì)引物; PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序結(jié)果在去除載體序列后與原序列進(jìn)行比對(duì)，分析測(cè)得的序列是否位于上下游引物之間;在qRT-PCR 中，可以通過熔解曲線來判斷引物的特異性，若熔解曲線為單峰則說明引物的特異性好。通過上述3 種方法均可以對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性檢測(cè)，以便篩選特異性較好的引物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增效率的計(jì)算: 相對(duì)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性還受到目的基因和內(nèi)參基因的PCR 擴(kuò)增效率影響。一般來說，擴(kuò)增效率接近100%是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)使得結(jié)果重復(fù)性好且可靠的最好標(biāo)志。實(shí)際操作時(shí)，反應(yīng)的擴(kuò)增效率應(yīng)該在90% ～ 105%之間，如果擴(kuò)增效率低，可能原因是引物設(shè)計(jì)不佳，或是反應(yīng)的條件沒有優(yōu)化;擴(kuò)增效率大于100%時(shí)，可能的原因有非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，如引物二聚體、錯(cuò)配等引起的PCR 產(chǎn)物產(chǎn)生。傳統(tǒng)計(jì)算擴(kuò)增效率的方法是將已知模板稀釋成一系列梯度濃度( 不少于5 個(gè)點(diǎn)) ，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，利用拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值和Ct值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)劣有兩個(gè)指標(biāo)，相關(guān)系數(shù)( r) 和斜率。相關(guān)系數(shù)反映標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線性，越接近1 說明直線性越好，定量越精確; 斜率與擴(kuò)增效率相關(guān)，計(jì)算公式: 擴(kuò)增效率( E) = 10( - 1 /斜率) - 1。在PCR 過程中，擴(kuò)增效率在指數(shù)期相對(duì)穩(wěn)定，但是隨著循環(huán)數(shù)的增加，Taq 酶、脫氧核糖核苷三磷酸( dNTP) 、引物，甚至DNA 模板等各種PCR 要素逐漸不敷需求，擴(kuò)增效率也就越來越趨向于0。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的擴(kuò)增效率不能反映PCR 進(jìn)程中擴(kuò)增效率的變化。由于PCR 結(jié)果往往是通過Ct值來計(jì)算的，由擴(kuò)增效率引起的最終差異只能反映在Ct值上的變化。
為了減小這種情況引起的誤差，在定量時(shí)確保各樣品濃度值在一系列梯度濃度的范圍內(nèi)，即Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。此外，尚有根據(jù)PCR 進(jìn)程中的原始數(shù)據(jù)或擴(kuò)增曲線的形狀，再基于不同的數(shù)學(xué)算法開發(fā)出來的一些軟件來計(jì)算擴(kuò)增效率的。這些算法或軟件使得擴(kuò)增效率的計(jì)算更加簡(jiǎn)單易行，特別是對(duì)于那些表達(dá)量很低的基因很難通過一系列的梯度稀釋來求擴(kuò)增效率。該方法缺點(diǎn)是不同軟件基于的算法不同，因此各軟件得到的結(jié)果也有差異; 噪音導(dǎo)致可用的數(shù)據(jù)點(diǎn)很有限，計(jì)算的擴(kuò)增效率也就不精確。
2. 2. 3 數(shù)據(jù)處理方法對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)需求，我們可以采用不同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，在這里只討論以內(nèi)參基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)的相對(duì)定量方法。常用的方法有雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法、2-△△Ct法、用參照基因的△Ct法和Pfaffi 法，應(yīng)用每種方法必須對(duì)應(yīng)適應(yīng)的條件。雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法: 首先分別對(duì)目的基因和看家基因的5 個(gè)( 盡量不少于5 個(gè)點(diǎn)) 濃度梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品制作兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線。各待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，得到目的基因的Ct值，分別代入目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到看家基因的Ct值，分別代入看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣就可以換算出各待測(cè)樣品目的基因和看家基因的起始模板量。其次，利用內(nèi)參對(duì)各待測(cè)樣品進(jìn)行歸一化，即用目的基因的定量結(jié)果除以看家基因的定量結(jié)果。最后對(duì)不同樣品之間目的基因的表達(dá)量進(jìn)行比較，通常將對(duì)照樣品的表達(dá)量作為1，計(jì)算出相對(duì)量，再進(jìn)行樣品間相對(duì)量比較。2-△△Ct ( Livak) 法: 2-△△Ct 法是定量PCR 實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對(duì)變化的一種簡(jiǎn)便方法，但條件是目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率都接近100%，且相互間效率偏差在5% 以內(nèi)，否則會(huì)產(chǎn)生較大的誤差。
使用2-△△Ct 法之前，必須驗(yàn)證目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。其操作步驟如下: 首先，對(duì)所有的待測(cè)樣品和對(duì)照樣品，用內(nèi)參基因的Ct值歸一化目的基因的Ct值: △Ct = Ct( 目的基因) - Ct( 內(nèi)參基因) ; 其次，用對(duì)照樣品的△Ct值歸一化待測(cè)樣品的△Ct值: △△Ct =△Ct( 待測(cè)樣品) -△Ct( 對(duì)照樣品) ; 最后，計(jì)算表達(dá)水平比率: 表達(dá)量的比值= 2 -△△Ct。如果目的基因和內(nèi)參基因有同樣的擴(kuò)增效率，但是擴(kuò)增效率不等于2，那么2 -△△Ct 法的公式可以修正為用實(shí)際擴(kuò)增效率值代替等式中的2。如果目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不相近，可以優(yōu)化或重新設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。用參照基因的△Ct法: 用參照基因的△Ct法是2 -△△Ct法的一種變化形式，它更容易掌握且結(jié)果相同。與2 -△△Ct得到的△Ct值相比，△Ct法是每個(gè)樣本之間參照基因與目的基因的Ct值的差值。雖然這種方法的操作步驟簡(jiǎn)單，但同樣也能真實(shí)衡量基因表達(dá)水平，將參照基因的表達(dá)水平計(jì)算在內(nèi)。結(jié)果顯示，主要的差異是校準(zhǔn)樣本的表達(dá)水平不是1。如果用這個(gè)方法得到的表達(dá)值除以所選的校準(zhǔn)樣本的表達(dá)值，計(jì)算結(jié)果與2 -△△Ct 法的結(jié)果正好相同，即表達(dá)量的比值= 2( △Ct( 內(nèi)參基因) -△Ct( 目的基因) )Pfaffi 法: 當(dāng)目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相近時(shí)，用2 -△△Ct法定量相對(duì)基因表達(dá)是最合適的方法，但是如果兩個(gè)擴(kuò)增子擴(kuò)增效率不同，必須選擇另一種方法來確定不同樣本之間目的基因的相對(duì)表達(dá)量。Pfaffi 法則是目前最好的選擇方法，計(jì)算公式為:表達(dá)量的比值= C( A - E) /D( F - B) ( C 和D 分別是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率; A 和E 分別是對(duì)照樣品和待測(cè)樣品中目的基因的Ct值; F 和B 分別是待測(cè)樣品和對(duì)照樣品中內(nèi)參基因的Ct值) 。
2. 2. 4 歸一化歸一化是對(duì)所有樣品之間的差異進(jìn)行校正。不同的樣品，即使反應(yīng)時(shí)使用相同量的總RNA，但因細(xì)胞來源不同，RNA 總表達(dá)量并非一致。因此僅僅將反應(yīng)時(shí)RNA 量統(tǒng)一，起始的細(xì)胞數(shù)也不一定相同。其實(shí)在進(jìn)行表達(dá)量分析時(shí)，比較的是相同數(shù)量細(xì)胞中的某個(gè)基因拷貝數(shù)目。實(shí)際上要將樣品材料統(tǒng)一到相同細(xì)胞數(shù)提取是非常困難的，同時(shí)還不能保證RNA 提取效率、反轉(zhuǎn)錄效率以及PCR 擴(kuò)增效率完全相同�；谏鲜鲈�，在進(jìn)行表達(dá)量分析時(shí)，有必要選擇內(nèi)參基因?qū)λ袠悠愤M(jìn)行歸一化處理，以獲得目的基因特異性表達(dá)的真正差異。
篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因后，先對(duì)目的基因歸一化處理，然后進(jìn)行表達(dá)差異分析。目前進(jìn)行歸一化分析的方法有兩種: 單基因歸一化和多基因歸一化。實(shí)時(shí)熒光定量最早被用于基因表達(dá)差異分析時(shí)，大多文獻(xiàn)報(bào)道都是以單個(gè)基因作為內(nèi)參基因，對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行歸一化。然而，基于單一內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化存在許多缺點(diǎn)，可能導(dǎo)致比較大的誤差。因此，多個(gè)看家基因開始被應(yīng)用于歸一化分析中。
3 在中藥領(lǐng)域中的應(yīng)用
3. 1 基因表達(dá)分析
熒光定量PCR 最普遍的應(yīng)用是基因表達(dá)分析。從基礎(chǔ)科學(xué)研究到實(shí)際應(yīng)用，檢測(cè)基因表達(dá)都是基本的也是很重要的一項(xiàng)工作。Olofsson 等對(duì)黃花蒿不同組織中萜類代謝途徑上的基因進(jìn)行表達(dá)差異分析，為評(píng)估青蒿素的前體對(duì)青蒿素產(chǎn)量的影響提供科學(xué)參考。植物在生物和非生物脅迫下，基因表達(dá)水平的相對(duì)變化與次生代謝產(chǎn)物累積相關(guān)性的研究越來越受到科研工作者的青睞。如Cheng 等用YE、Ag + 和MeJA 3 種誘導(dǎo)子組合誘導(dǎo)丹參毛狀根。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在處理24、36 h 后，SmCPS 的表達(dá)量顯著上調(diào)，次生代謝產(chǎn)物隱丹參酮和二氫丹參酮Ⅰ的含量也隨之顯著上升，這表明丹參酮類化合物含量的升高可能與SmCPS 基因表達(dá)量的上調(diào)有關(guān)。在植物的不同發(fā)育階段，其次生代謝產(chǎn)物的累積量及基因的表達(dá)水平也會(huì)不同。如Kim 等對(duì)人參在葉片不同開放期( 閉合階段、中間階段、全開放階段) 其體內(nèi)人參皂苷及生物合成途徑上的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在中間階段和全開放階段人參皂苷生物合成途徑上的酶基因PgSS 和PgSE 的表達(dá)量比閉合階段增加約1. 5 倍，PgDDS 的表達(dá)量則增加4 倍以上; 主根和側(cè)根中，人參皂苷的含量在葉片開放的中間階段達(dá)到最大值，而葉片中人參皂苷的含量在全開放階段達(dá)到最高。此外，實(shí)時(shí)熒光定量的差異表達(dá)分析在中藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如在甘草、黃花蒿等藥用植物中都有大量的研究。
3. 2 中藥品種及真?zhèn)舞b別
中藥的真?zhèn)沃苯佑绊懪R床用藥的準(zhǔn)確性和中藥的質(zhì)量，因此對(duì)于中藥品種真?zhèn)蔚蔫b別歷來是中藥研究中極為重要的工作。Xue 等依據(jù)骨碎補(bǔ)的正品及其混淆品trnLtrnF間隔序列，設(shè)計(jì)Scorpion 探針，通過實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)骨碎補(bǔ)的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，同時(shí)對(duì)多個(gè)混合樣品( 正品中加入一種混淆品，按一定比例梯度混合)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以分析正品中混淆品的摻入量。另外，Xue 等基于升麻及其替代品之間內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)( ITS) 序列的長(zhǎng)度、鳥嘌呤( G) 、胞嘧啶( C) 含量的差異，采用LightCycler 定量?jī)x擴(kuò)增升麻及其替代品的ITS 序列，并分析各產(chǎn)物的熔解曲線。通過解鏈溫度的差異區(qū)分鑒別升麻及其替代品，為快速、穩(wěn)定鑒別升麻及其替代品建立了標(biāo)準(zhǔn)。董玉茹等將限制性內(nèi)切酶引入熔解曲線分析中，建立了一種新的單核苷酸多態(tài)性( SNP) 分型方法，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)金銀花與山銀花、白術(shù)與蒼術(shù)品種及真?zhèn)蔚蔫b別。此外，有研究者基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，分別對(duì)鐵皮石斛近緣種冒充鐵皮石斛以及三七粉摻假等現(xiàn)象建立快速的檢測(cè)方法。
4 小結(jié)
植物在生長(zhǎng)、發(fā)育及受外界環(huán)境刺激等過程中，其基因在不同時(shí)空的表達(dá)存在著很大差異。對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，是了解生物體生長(zhǎng)、發(fā)育和調(diào)控等機(jī)理的一個(gè)重要內(nèi)容。Northern 雜交、Southern 雜交和原位雜交等都可以用來進(jìn)行目的基因的定量分析，但這些方法耗時(shí)且敏感性較差。普通PCR 終點(diǎn)定量的缺陷是擴(kuò)增出來的DNA 產(chǎn)物需要通過瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠( EB) 染色后才可以顯示出來，這些步驟耗時(shí)且不易精確定量。此外，由于酶動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn)，在PCR 反應(yīng)進(jìn)程中有基線期、早期指數(shù)期、對(duì)數(shù)-線性期和平臺(tái)期，理論上來說，所有樣本的DNA 擴(kuò)增量最后是相同的，但實(shí)際上，不同樣本的平臺(tái)期是不一樣的。在這種情況下，通過終點(diǎn)定量分析，反而將反應(yīng)效率中很小的差別放大出來，造成定量的不準(zhǔn)確。實(shí)時(shí)熒光定量為起始定量，誤差相對(duì)較小，這使其在定量方面得到快速的發(fā)展。PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度或組成不同，其熔解曲線( 熔鏈溫度) 也存在差異，因此可根據(jù)熔解曲線的差異進(jìn)行物種的鑒別。中藥鑒定要解決其中一個(gè)很重要的問題就是真?zhèn)�。�?shí)驗(yàn)過程中，我們可通過設(shè)計(jì)特異性引物來擴(kuò)增不同的樣品，從而得到不同的PCR 產(chǎn)物，再根據(jù)相應(yīng)的熔解曲線鑒定中藥材的真?zhèn)魏蛽絺蔚闹兴幉�。此外，�?shí)時(shí)熒光定量PCR 還可廣泛用于等位基因分析及轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)等。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR 自建立以來，發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛，擁有許多優(yōu)點(diǎn)。近年來，許多科研工作者基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的基本原理對(duì)其進(jìn)行不斷地研究和改進(jìn)，使實(shí)時(shí)熒光定量PCR 得到了進(jìn)一步的完善。隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的不斷標(biāo)準(zhǔn)化，該技術(shù)將在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究等科研領(lǐng)域中得到更加廣泛的推廣與應(yīng)用。
【實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究進(jìn)展及其在中藥領(lǐng)域的實(shí)踐的論文】相關(guān)文章：
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